我對於生物膜的治療策略

游朝慶

   生物膜讓我們知道，細菌是集體、聯合作戰的，並且當其集結起來後，會形成一堵防護罩，如同超級戰艦(Battleship)(2012)電影裡外星人集結後，母艦就發射了防護罩，讓絕大部分的抗菌劑失掉了功能。我想，biofilm這元素，也許就是為何長久以來，在慢性傷口上的研究都顯示使用抗菌敷料並無法加速傷口癒合的關鍵，以致於說在實證醫學上慢性傷口上使用銀敷料沒有臨床效益。但一旦有了生物膜這概念，我們知道，作戰不能只靠英雄（抗菌劑），需要有戰略，如以前羅馬士兵會以盾牌集體組成龜甲陣（圖8），對抗時，便無法用傳統的刀劍來殺敵，但若能以大砲，或投石器等重武器將敵軍打散之後，便有可能緊接著以傳統的弓箭來將敵軍一一殲滅。這重武器在感染性傷口而言，就是『清創』。


https://blogger.googleusercontent.com/img/b/R29vZ2xl/AVvXsEhYFUkA3K1nil92d-PszpzcYb8v_daESI7m74C_d1xiU9ZzcX-QIZ_xjTm52Wvks8HEFd6exqMaui1-yqZmu0YDnQBfu0cb5nXTHjBhfSaW6VbFIKrotOYhvA0cCOnBjGljpffuCJxPDBs/?imgmax=800

圖8. 攻城的羅馬士兵以盾牌組成龜甲陣，來防禦攻擊，From Poliorceticon by Justus Lipsius (Antwerp; 1605) http://www.fotolibra.com/gallery/1019370/roman-soldiers-forming-a-tortoise/?search_hash=c91aabbeef4a3304d9943cf9259c1509&search_offset=0&search_limit=100&search_sort_by=relevance_desc

   至於我對於生物膜（因為肉眼看不到生物膜，所以或許只能說對於slough或感染性傷口）的治療策略為：1.若患者住院，有全身性感染現象，如發燒、白血球高，或傷口旁有紅腫熱痛，需先以抗生素治療，並需先排除掉動靜脈血液循環的問題，若傷口有膿、惡臭，則需在開刀房內先清創，以curette、剪刀、刀片儘量清除看得見的壞死組織以及slough，對於看不見或懷疑的部分（如表面部分壞死的筋膜）則以電燒加以破壞，接著以雙氧水紗布浸泡傷口5分鐘，以止血及破壞殘存細菌，最後以生理食鹽水紗布緊密填塞（wet-to-dry），若隔天紗布上呈現乾淨顏色，則持續以生理食鹽水紗布填塞bid（利用濕紗布的wet-to-dry對傷口持續清創，但不要開tid的order，加重護理人員的loading，若傷口真的很髒，還是需要進開刀房清創，個人認為aquacel(或Aquacel-Ag)幾乎沒有清創的作用，其吸水後就呈現凝膠狀，優點是不會產生沾黏，避免流血，缺點是往往敷料拿起來後，下面仍然是一層厚厚的slough卡在傷口上，等待被清創），但若過幾天紗布呈現綠色或有味道，或組織逐漸呈現壞死，則考慮再度清創，並且每次換藥時以乾紗布將傷口上的slough刷掉，並且消毒（使用優碘或雙氧水，若強烈懷疑是綠膿桿菌感染，則也考慮使用醋酸消毒，雖許多guideline建議傷口上不要使用任何殺菌劑，但個人認為那是在傷口無感染，準備長肉芽組織的階段，若傷口有感染、味道、髒的滲液時，還是建議使用各種殺菌劑，並配合清創，且殺菌劑其實並不會抑制傷口生長，請詳見之前的文章『優碘可促進傷口癒合』），等沒有感染現象後，再改用aquacel(或Aquacel-Ag)填塞，並讓患者出院。2.若在門診，則還是先清創，以curette、剪刀或乾紗布儘量清除看得見的壞死組織以及slough，以不流血為原則，接著以aquacel-Ag填塞，每個禮拜回診，若仍有壞死組織或slough則持續清創，等到傷口乾淨後，改用aquacel填塞，並延長回診時間，等滲液減少後，再改用凝膠及泡綿敷料。
   據說Aquacel-Ag目前已升級到Aquacel-Ag+，據說這新型敷料對生物膜有特別效果，但對於slough的清創效果，我仍抱持保留態度，個人認為清創仍是最重要的，可大量減少bacterial burden，接著aquacel-Ag+的地位應該是去抑制biofilm的形成，並且趁著biofilm未形成前去殺掉細菌。如同牙齒的牙菌斑，雖然說一些Chlorhexidine成分漱口水及含Xylitol木糖醇的口香糖號稱能有效減少牙菌斑，但是仍然無法取代刷牙。

治療生物膜的原則

游朝慶

   即使當一個傷口已被強烈懷疑有生物膜感染，目前仍然沒有一招斃命的療法，根據傷口床準備的原則⁴⁴（圖7），使用聯合策略的主動方式或許可能有效：1.降低生物膜的量2.防止生物膜再度形成，這種方法有時被稱為『生物膜導向的傷口治療biofilm-based wound care』

圖7. 傷口生物膜的處理原則
 

如何減少生物膜總量？How can biofilm be reduced?

   清創包括移除傷口中壞死及受感染的組織，以促進傷口癒合。清創有許多種方法，從外科清創（sharp debridement）到灌洗傷口(wound irrigation)^45,45，醫師根據其知識、受訓門派、能力、安全及醫學倫理考量，來決定使用何種清創方法⁴⁷。到目前為止，針對生物膜的清創處理方法為使用剪刀、手術刀scarpel、刮匙curette等器械的外科清創，使用蛆的生物性清創，使用酵素的化學性清創，以及使用超音波刀或電燒來清創，需要將所有的傷口隧道打開、移除潛行性傷口、所有的壞死組織、腐肉、及無血色、軟的骨頭⁴⁸。然而，因為生物膜是肉眼看不見的，故無法評估各種清創的效果，因此目前仍無法知道哪一種清創方法是最好的。
   但就如同刷牙般，沒有說電動牙刷或哪一種牙刷比較好，就都是要把牙菌斑刷掉，目前也沒有任何一家漱口水或洗牙機可宣稱其可不靠刷牙就能預防牙菌斑，故動自己的手每天刷牙，並定期去給牙醫師檢查及洗牙，才是預防蛀牙的最好方法，但若日後真有可殺死並去除牙菌斑的漱口水問世，怕許多牙醫就真的要失業了。
 

清創的頻率

   沒有任何一種方法可以一次清除所有的生物膜，因此殘留下來的生物膜都有可能在一天內就重建完成，當傷口懷疑有生物膜時，需要接受定期的清創，然而需要多久清一次仍沒有定論，有研究指出，當患者肢體有嚴重循環不良時(critical limb ischemia; CLI)，需要每週都清一次傷口⁴⁸。有一些產品被認為可移除細菌、阻礙生物膜，因而對傷口的清潔有幫助，比如說B. Braun公司推出的Prontosan Wound Irrigation Solution博坦舒傷口沖洗液，其含有可殺菌的Polyhexamethylene biguanide (PHMB)，以及有介面活性劑surfactant功能的betaine^49,50。

如何預防生物膜再被重建

   生物膜有三種可能管道會被重建：1.清創後殘留的生物膜碎片2.從殘存生物膜釋放出來的浮游細菌3.新感染的細菌。因此預防的原則包括使用敷料來防止傷口再被污染。以及使用抗菌劑來殺死浮游的細菌，因為生物膜往往是多種細菌組合的，因此使用廣效性抗菌劑（敷料）來殺死（而非抑制）細菌是合理的選擇，儘管抗菌劑（敷料）對生物膜再形成的效果仍未知，然而在傷口中最普遍被使用的抗菌劑（敷料）為銀、碘、蜂蜜以及PHMB。乳鐵蛋白（Lactoferrin）和木糖醇（Xylitol）也被認為對生物膜有效⁵¹。但儘管木糖醇口香糖已被數以百篇的研究證明說可有效預防蛀牙，但目前仍沒有任何一位牙醫師敢說木糖醇可取代刷牙。
  對於抗菌劑（敷料）的新使用原則是，若這一種抗菌劑無效，就再換另一種，因此並沒有證據說哪一種抗菌劑是該被第一線使用，重點是該如何使用，比如說是否要使用持續釋放的抗菌劑（敷料）以便敷料能在傷口上停留幾天。
根據維基百科⁵²，爲防止某些情況下的生物膜形成，還有如下辦法：

預防性：

1. 防止營養物沉積
2. 特殊的表面使細菌無法附著（「荷葉效應」，或稱蓮花效應(Lotus effect)，因蓮葉具有疏水、不吸水的表面，落在葉面上的雨水會因表面張力的作用形成水珠，即由於荷葉表面有自然的奈米級尺寸顆粒，若透過電子顯微鏡觀察葉子表面結構，會發現葉子表面這些奈米微粒形成小球狀凸起，而這些微小纖毛結構讓污泥、水粒子不容易沾附，而達到自潔的功效)，如疏水性極強的表面、帶負電荷的表面、heparin的塗層、緩釋抗生素的塗層、銀離子塗層；都能讓微生物難以附著

物理方法：

1. 超音波
2. 電刺激Pulsed electric fields (electrical stimulation at a low voltage -0.5 to 5v)
3. 磁場
4. 高壓氧
5. 加熱
6. 紫外線UV
7. 負壓傷口治療NPWT

化學方法：

1. 抗生素
2. 去污劑
3. 過氧化氫(H2O2據說對生物膜效果不好，谷歌說：生物膜中的細菌對抗生素、過氧化氫或者去污劑的抗性比游離細胞高可達400倍。)
4. 螯合劑（如EDTA乙二胺四乙酸，研究證實其能與構成細菌或真菌生物膜所必需的某些金屬離子如Mg2+、Ca2+、Fe2+等發生結合，從而破壞生物膜的結構，並也能夠殺死細菌。）
5. 乳鐵蛋白（Lactoferrin）和木糖醇（Xylitol）
6. 鎵Gallium 非常像鐵，許多生物系統搞不清楚Ga3+及Fe3+
7. 分散蛋白B (Dispersin B)

生物調控方法：

1. 加入「群聚感應」(quorum sensing)中誘導物的相似物質從而抑制「群聚感應」。
2. 噬菌體bacteriophage

我如何知道生物膜已不見了

最明顯的是傷口開始癒合，伴隨著滲液exudate及腐肉slough的變少。

未來的發展

   應該需要發明一種方法來快速檢測生物膜的存在，以幫助研究者及臨床工作者發展出有效的治療策略，並追蹤治療的成效。目前抗菌敷料對生物膜的成效仍有賴於密切的觀察。
   但在英文版的維基百科（https://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm）中有提供兩個產品：由OrigaLys ElectroChem SAS公司製造的BioFilm Monitor（圖8），根據電化學electrochemical的測量，其可測量生物膜的厚度及其成分，不過感覺有點複雜及貴。 第二個是由Realco製造的生物膜染色劑 coloration tool: Biofilm Detection Kit（圖9），這個看起來似乎比較簡單使用，5分鐘之內就可得知有無生物膜。

圖8. BioFilm Monitor（http://www.origalys.com/products/biofilm-monitor-legionella-risk-management）

圖9. BioFilm Monitor（http://www.realco.be/en/our-markets/food-beverage/biofilm-audit/biofilm-detection-kit/）

   最近有一個研究顯示優碘粉Iodosorb(cadexomer iodine)對於成熟的綠膿桿菌生物膜可以有效地治療⁵³。然而由於生物膜多由多菌種組成，變異性及複雜性較高，對於抗菌劑的選擇仍然需因人而異。

要如何跟患者解釋生物膜？

   可以跟患者保證生物膜可以藉由聯合清創、敷料以及抗菌劑的合併使用來被有效治療，但仍然需要告知患者仍然需要反覆及持續治療一段時間，因為生物膜有可能會在一天內就復發並影響傷口癒合。 (本文結束)
44. Wolcott RD, Kennedy JP, Dowd SE. Regular debridement is the main tool for maintaining a healthy wound bed in most chronic wounds. J Wound Care 2009; 18(2): 54-56
45. Vowden KR, Vowden P. Wound debridement, Part 1: non-sharp techniques. J Wound Care 1999; 8(5): 237-40.
46. Vowden KR, Vowden P. Wound debridement, Part 2: sharp techniques. J Wound Care 1999; 8(6): 291-94.
47. O’Brien M. Debridement: ethical, legal and practical considerations. Br J Community Nurs 2003; 23-25.
48. Wolcott RD, Rhoads DD. A study of biofilmbased wound management in subjects with critical limb ischaemia. J Wound Care 2008; 17(4): 145-55.

49. Kaehn K, Eberlein T. In-vitro test for comparing the efficacy of wound rinsing solutions. Br J Nurs 2009; 18(11); S4-10.
50. Andriessen AE, Eberlein T. Assessment of a wound cleansing solution in the treatment of problem wounds. Wounds 2008; 20(6): 171-75.
51. Ammons MC, Copié V. Mini-review: Lactoferrin: a bioinspired, anti-biofilm therapeutic. Biofouling. 2013;29(4):443-55.
52. 生物薄膜，維基百科，https://zh.wikipedia.org/wiki/生物薄膜
53. Phillips PL, Yang Q, Sampson E, Schultz G. Effects of antimicrobial agents on an in vitro biofilm model of skin wounds. Advances in Wound Care 2010; 1: 299-304.

生物膜如何抑制傷口生長？

游朝慶

   生物膜會刺激宿主，而宿主會了驅逐生物膜會產生慢性發炎反應（如圖6），這反應導致眾多中性球及巨噬細胞包圍住生物膜，這些發炎細胞釋放出高濃度的活性氧化物（reactive oxygen species(ROS)，一種自由基），及蛋白質酶(酵素)（Proteases)及elastase（彈性蛋白酶），這蛋白質酶指的正是matrix metalloproteases(MMP，基質金屬蛋白酶，是可分解細胞外基質(extracellular matrix,ECM) 蛋白的酵素，破壞生物膜和傷口組織間的附著連結，讓生物膜可以脫離傷口組織⁴²，是目前傷口界正被炒熱的話題，然而蛋白質酶及活性氧化物其量太多也會傷害正常組織、及免疫細胞，這種脫靶效應(off target effect)接著就會抑制傷口生長，故一些新型敷料號稱能抑制或吸收多餘、無效的MMP。

圖6. 抑制傷口生長的宿主及細菌因素
   這種慢性發炎反應總是無法成功地移除生物膜，甚至有假說認為，這種無效的攻擊竟然是生物膜的陰謀，其刻意誘發無效的發炎反應，使得生物膜不但可保護其內的細菌不受到攻擊，藉此並且能增加傷口的滲液產生，而這滲液竟又能夠成為細菌生物膜的營養來源，使得生物膜生生不息⁴³。

有哪些狀況會使得傷口容易產生生物膜？

   目前並不知道哪些狀況下傷口會產生生物膜，然而一般狀況下，當免疫低下或抗生素無效時，傷口比較容易產生生物膜，包括組織缺血、壞死、營養不良或有合併症等免疫低下狀況。但一般還是需要在有水的環境。
42. European Wound Management Association (EWMA). Position Document: Wound Bed Preparation in Practice. London: MEP Ltd, 2004.
43. Lawrence JR, Swerhone GD, Kuhlicke U, Neu TR. In situ evidence for microdomains in the polymer matrix of bacterial microcolonies. Can J Microbiol 2007; 53(3): 450-58.

生物膜能被看見嗎？

游朝慶

   生物膜是電子顯微鏡下的結構，然而，在某些情況下，生物膜能沒有阻礙地生長，並經歷一段時間，此時，有可能生物膜可以長厚到能被肉眼看見，例如牙菌斑tooth plaque能在一天內長到能被看見。有些細菌在生物膜的型態下，會產生色素，如此也能有助於辨別生物膜，例如生物膜狀態下的綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa，其所發出『群聚感應』信號的綠膿菌色素Pyocyanin是綠色的²⁹，然而，儘管如此，傷口中發現綠色染色也不一定是綠膿桿菌感染。

生物膜能和腐肉slough區分嗎?

   傷口的腐肉slough通常被描述為在傷口床上面一層黏稠、黃色及不透明的膜層（圖2），而傷口上的生物膜也被描述為凝膠狀(gel-like)且帶有光澤的(shiny)³⁰。

圖2、right diabetic foot ulcer with slough
   儘管如此，這兩者間應該還會有一些相關吧。生物膜會刺激組織導致發炎，增加血管通透性，導致傷口滲液量變多，因而形成了血纖維蛋白腐肉fibrin slough³¹，因此，腐肉可暗示著生物膜在傷口的存在，然而如此的關連仍然需要進一步的證實，而目前偵測生物膜最可靠的方法還是電子顯微鏡，如雷射掃描共軛焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy）。圖3是生物膜各時期的電子顯微鏡觀察照片。如此可知，生物膜在大多數狀況下是看不到的，但既然我們可以使用染料讓牙菌斑現形，在慢性傷口，為何沒有人想說做個特殊染料讓生物膜現形，以方便清創治療及證實生物膜的存在。（謎之音：請谷歌Biofilm Detection Kit – Realzyme）

圖3、細菌生物膜的形成過程。上圖是卡通示意圖，下圖則為該時期對應的電子顯微鏡觀察照片。 (圖片來源： http://mathbio.colorado.edu/mediawiki/index.php/MBW:Role_of_Biofilm_Matrix_in_Structural_Deve lopment，http://fun.nmns.edu.tw/files/userfiles/來偷聽細菌們的對話吧！.pdf)
   很多人喜歡用下面這個圖（圖4）來解釋slough就是巨大的biofilm，或者說slough的表面黏黏的，就是可抵抗外界壓力的biofilm，但這是不對的，biofilm是緊密附著於傷口表面(圖5)，細菌的厚度大小約1微米（micrometers，µm，百萬分之一米），人類的細胞大小約10-100微米，而biofilm的總高度可達到10-30微米，最高可達100微米，雖然如此，也是和人類的細胞厚度差不多，也是肉眼看不到吧！而在biofilm外面還有一層對抗外界流速（剪力）的保護層稱為邊界層(hydrodynamic boundary layer)，最外面也還有一層極厚的基礎液體層（bulk liquid）。但仍然沒有學說認為這基礎液體層就是slough，通常認為slough主要成分是蛋白質，大都是由宿主分泌組織液及富含蛋白質的壞死組織以及一部份脫離的細菌生物膜碎片組成，其很適合細菌生長，故容易形成biofilm，而不是biofilm去形成slough。因此『傷口達人』網站上的這張圖（圖6）是錯的。

圖4. biofilm (圖片來源： http://www.coe.montana.edu/biofilmbook/module_07/Mod07_S03_Blue.htm)

圖5.Biofilm的四層結構：地基substratum、生物膜biofilm、邊界層boundary layer及基礎液體層bulk liquid
(圖片來源：http://2011.igem.org/Team:ZJU-China/Biofilm)

圖6. Biofilm (圖片來源： http://amedwound2013.pixnet.net//blog/post/42155764-受傷的地方黃黃的，那個是甚麼呢？(下)

成熟的生物膜如何保護細菌

   生物膜能使在其裡面的細菌增加對免疫系統、抗生素及缺乏營養及氧氣環境的耐受度³²。方法有三：1.blocking封鎖，EPS保護細菌最簡單的方法就是避免大分子的抗體及免疫細胞穿透生物膜，而更成熟的生物膜甚至可以防止小分子的抗生素滲透進去³³。2.Mutual protection聯盟或稱共同防禦，在多種細菌的生物膜內，不同的細菌會互相合作共同抵禦外侮，如有抗藥性的細菌會分泌保護因子來保護其周遭無抗藥性的細菌⁶。或者將其帶有抗藥密碼的基因與其他細菌交換³⁴。有研究顯示綠膿桿菌形成的生物膜，可以使後來加入的大腸桿菌更容易存活及繁殖³⁵。3.Hibernation休眠(quiescent bacteria處于靜止狀態的細菌)，另一個策略就是讓在生物膜內的細菌冬眠^6,36,37，細菌(bacteria)是一種具有細胞壁、細胞膜的生物，其生長繁殖需要合成蛋白質和核酸 (nucleic acid) (包括去氧核糖核酸DNA與核糖核酸RNA)，而且透過代謝葉酸(folic acid)完成生理機能，抗生素可破壞這些結構與生化反應，達到對抗細菌的治療效果，但一旦細菌進入休眠停止生長，抗生素就對細菌無可奈何^6,38。許多研究也證實說，需要抑制或殺死生物膜內細菌的最低抗生素濃度遠遠大於許多抗生素的最高允許劑量^38-41，所以說一般標準的口服抗生素只能對浮游的細菌有效，但對於生物膜內的細菌可是完全無效。

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生物膜多快會形成？

游朝慶

  有研究顯示^23,24，浮游細菌(planktonic bacteria)如Staphylococci, Streptococci, Pseudomonas及Escherichia coli，通常：

• 幾分鐘內會附著
• 2-4小時內會集結完畢
• 6-12小時內會產生初步的EPS
• 2-4天會完成成熟的生物膜

  之後即使遭受機械性的破壞，如清創，也能在24小時內將生物膜修復完成，這意味著，清創手術後，患者僅僅只能擁有短暫24小時的黃金時間，讓抗生素能有效殺死生物膜內的細菌。

                                                                                       補充：NPUAP官方的標準答案是『3天』

為何我們要一直花很大力氣去搞清楚傷口中的生物膜

   一直到最近，生物膜才被接受是影響傷口不癒合的原因^7,10，慢性皮膚傷口通常不會有明顯的發炎反應，並且以標準的實驗室檢查也只能發現極少量的細菌²⁵。然而標準的微生物實驗室檢查(CFU)卻只能培養出浮游的細菌(planktonic bacteria)，而無法檢驗出生物膜內的細菌，生物膜需要特殊的培養技術^26,27。臨界細菌集結量(Critical Colonisation)這個詞被發展出來用來瞭解為何細菌在沒有造成明顯感染的狀況下竟會影響傷口的癒合²⁸，事實上，臨界細菌集結量或局部感染（localised infection）的概念通常意味著慢性傷口有生物膜的存在。
7. Wolcott RD, Rhoads DD, Bennett ME, et al. Chronic wounds and the medical biofilm paradigm. J Wound Care 2010; 19(2): 45-50, 52-53.
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