游朝慶 醫師
今天，正研究著一張資料圖表，ConvaTec公司給的，介紹他們家新出的一種敷料aquacel-Ag+ Extra，封面（如圖1）看起來像是發表於傷口雜誌的研究論文，ConvaTec最近在積極推廣宣傳，相信很多人有拿到這一本，若沒有，網路上也有pdf(http://www.convatec.sk/media/files/next-generation-antimicrobial-dressings-aquacel-ag-extra.pdf)。 
圖1.封面 (圖片來源: http://www.convatec.sk/media/files/next-generation-antimicrobial-dressings-aquacel-ag-extra.pdf)
有一種新出來的抗菌敷料不用靠清創，就可以在一天之內將綠膿桿菌的生物膜的活菌總菌落數viable biofilm bacteria(CFU)減少6個零（從30億減到3千，也就是百萬分之一），而在第四天，讓生物膜數量歸零（圖2），這個資料幾乎就是細菌的『明日之後』了，對於有抗藥性的MRSA生物膜也是以每2天讓細菌減少到原本千分之一的速度，在第5天，讓生物膜數量歸零（圖3）。如此的神奇，已經比手術清創的效果還要神了，我每次在開刀房開完清創手術後，頂多只敢宣稱清完9成，需觀察個幾天，若傷口沒改善還是有可能需要再次清創。此敷料一出，大概像我這類做傷口的外科醫師就不用混了，無論如何，總還是覺得怪怪的，因為圖表的細菌單位用的是生物膜內存活細菌的『總菌落數CFU』。
(圖片來源: http://www.woundsinternational.com/media/other-resources/_/1069/files/content_11301.pdf
http://www.convatec.sk/media/files/next-generation-antimicrobial-dressings-aquacel-ag-extra.pdf）
(圖片來源:http://www.convatec.sk/media/files/next-generation-antimicrobial-dressings-aquacel-ag-extra.pdf)
而什麼是CFU呢？
菌落形成單位/毫升 (colony forming unit/ml；簡稱 cfu/ml)，是計算細菌數量的一種方法，其值越高表示樣品中所含的細菌越多。菌落形成單位的計量方式與一般的計數方式不同，一般直接在顯微鏡下計算細菌數量會將活與死的細菌全部算入，但是CFU只計算活的細菌。當單一的活細菌被移植至agar培養皿，經分裂後，其會形成一個菌落。故每一個活細菌，即是由一個菌落形成單位 (Colony forming unit；簡稱 cfu) 所代表。總生菌數是指食品在經過處理，並於一定條件下進行培養後，所得1 g或1 ml檢測樣本中所含的活細菌總數。傳統的方式是將檢體經過連續稀釋（以十的倍數），然後在培養皿培養出可計算菌落數目，接著計算Plate Count。但是這個方法只能計算水中懸浮的微生物planktonic bacteria，或是遷移中的生物膜碎片，大部分的生物膜是會緊密附著於管壁，且尚未成熟的生物膜系統是不會大量移轉到水中的，且每個生物膜碎片常只能培養出單一菌落，最後，據說在傳統的agar培養皿其實培養不出生物膜，因此傳統的總菌落數CFU（應該是cfu/ml）其實不是研究生物膜的好單位。不過也許研究者用了一種特殊的方法，溶解了生物膜的EPS外衣，卻不會傷害膜內的細嫩細菌，把生物膜內的所有細菌釋放出來，再用CFU的方法研究也不一定。就讓我進一步研究其研究方法。根據內文，作者發展出一種實驗室的抗菌評估模式(此作者David Parsons還是Aquacel-Ag及Aquacel-Ag+專利的發明家WO2012136968 A1)，用來研究Aquacel-Ag+ extra對於傷口中生物膜內細菌的抗菌效果1,2(謎之音：請參考ConvaTec的內部不公開文件：1,2，這句話怪怪的)，生物膜在一種低營養的培養基質中，藉著持續攪動48小時，在棉質紗布中生養。接著這生物膜的存在、成熟狀態及形狀被前文所述的雷射掃描共軛焦顯微鏡（Laser Scanning Confocal Microscopy）證實（如圖4）（謎之音：看到這裡似乎都還合理）。接著將含有生物膜的紗布物質轉移到陷在皮革表面的agar培養皿，以模擬傷口的環境（謎之音：漏餡了，agar並不是生物膜的培養環境，），接著將各種敷料（aquacel-Ag及aquacel-Ag+ extra）置於生物膜表面，加水保濕，並以第二層敷料覆蓋（看起來是防水的aquacel foam dressing），在這5天的培養中，每隔一段時間（24小時）就評估敷料對生物膜的抗菌效果（謎之音：到這個步驟為止，作者並沒有以任何方法，如超音波，將剩下殘存的生物膜打碎，以培養生物膜內的細菌，否則一個生物膜就只能培養出一個菌落），接著為了評估生物膜在被破壞後一天便會重建的條件，又緊接著將新鮮的細菌接種在敷料下面的紗布基質上，接著在其後的幾天培養並評估細菌的存活狀況（圖2及圖3）。（謎之音：圖2 MRSA的aquacel-Ag這組沒有歸零，且原本已被aquacel-Ag抑制成拉鋸狀態的30億大軍，在只補充3萬新軍後，竟然能夠隔天就迅速成長成300億大軍）
其實(這裡給ConvaTec一點秀秀)，根據作者David Parsons所發表Aquacel-Ag+的專利書WO 2012136968 A13上有寫到其詳細的研究方法，其利用商業模組化套件的The MBEC Assay System來培養及偵測生物膜（圖5），這方法改良自Calgary Biofilm Device抗生素對生物膜的敏感度測試方法，可同時培養及試驗96個生物膜4。
（圖來自http://www.biofilms.biz/products）
把培養出來的菌體加入MBEC Assay System中，並以純水持續在所有試管內流動，以創造製造生物膜所需的剪力，培養24小時後可肉眼看到生物膜在試管底部形成，以接著洗去多餘懸浮細菌。然後放入實驗抗菌物質，持續30分，2小時及4小時，接著以超音波振盪器 sonication method將生物膜破壞，使裡面存活的細菌釋放懸浮出來，稀釋，並在另一個新的培養皿上培養24小時，接著計算菌落數（圖6）。
1.WHRI3857 MA236. Antimicrobial activity and prevention of biofilm reformation by AQUACEL Ag+ EXTRA dressing. ConvaTec data on file.
2.WHRI3875 MA239. Antimicrobial activity against CAMRSA and prevention of biofilm reformation by AQUACEL Ag+ EXTRA dressing. ConvaTec data on file
3. WO 2012136968 A1 Composition comprising antimicrobial metal ions and a quaternary cationic surfactant, http://www.google.com/patents/WO2012136968A1?cl=en
4. H. Ceri,, M. E. Olson,C. Stremick, The Calgary Biofilm Device: New Technology for Rapid Determination of Antibiotic Susceptibilities of Bacterial Biofilms, J Clin Microbiol. 1999 Jun; 37(6): 1771–1776. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC84946/
5. Herrmann G, Yang L, Wu H, Colistin-tobramycin combinations are superior to monotherapy concerning the killing of biofilm Pseudomonas aeruginosa. J Infect Dis. 2010 Nov 15;202(10):1585-92. doi: 10.1086/656788. Epub 2010 Oct 13.
http://jid.oxfordjournals.org/content/202/10/1585/F1.expansion.html
接著是另一個研究，為了進一步瞭解生物膜被破壞及移除的現象，一種化學性的方法被研究出來6（謎之音：這方法只以海報形式發表於2013年英國的傷口年會，原海報檔為pdf），其研究方法看似合理，以aquacel, aquacel-Ag, aquacel-Ag+和biofilm接觸一天之後移開，並以鹽酸將對照組未破壞的biofilm及三種用過的敷料各自溶解，研究三種敷料及原本的生物膜內的Ca++,Mg++,K+關係，結果如下表。
表1. 研究三種敷料及原本的生物膜內的Ca++,Mg++,K+關係
總之，結果我只看到上面這三個表，看似沒什關係，但作者在結論卻非常傻眼地說根據鉀的濃度，aquacel，aquacel-Ag及aquacel-Ag+分別可移除生物膜達37%，66％及78％，此結果也符合肉眼的觀察。（謎之音：之前不是說aquacel以及aquacel-Ag無法殺死或破壞生物膜嗎？）
最後，我開始懷疑為何一個國際期刊會刊出這種不嚴謹的文章，連參考文獻都可以用內部資料帶過，最後找到說這些文章其實是出自於wound international的resource部分（http://www.woundsinternational.com/resources/biofilms），這部分的文章為由各贊助廠商所提供的衛教文章（廣告文），如一些Made Easy類的文章（如前文），當然有其商業的考量，但是作為臨床研究者，實在應該尋找一些真的經過peer review的文章，比如說aquacel Ag+和aquacel Ag相比，多了哪些成分，以及為何可以殺掉生物膜的機轉。
6.Parsons D, Short D, Meredith K, Rowlands V (2013). A new anti-biofilm Hydrofiber dressing: demonstrations of enhanced silver penetration and biofilm removal in vitro. Poster 215. Presented at Wounds UK 2013, Harrogate, UK: 11–13 November. SC-000388-GB. http://www.convatec.sk/media/files/2013-poster-215-parsons-aqagplus-penetration.pdf
