2015年11月2日 星期一

Aquacel-Ag+打臉文(ConvaTec不要看)

游朝慶 醫師
   今天,正研究著一張資料圖表,ConvaTec公司給的,介紹他們家新出的一種敷料aquacel-Ag+ Extra,封面(如圖1)看起來像是發表於傷口雜誌的研究論文,ConvaTec最近在積極推廣宣傳,相信很多人有拿到這一本,若沒有,網路上也有pdf(http://www.convatec.sk/media/files/next-generation-antimicrobial-dressings-aquacel-ag-extra.pdf)。

圖1.封面 (圖片來源: http://www.convatec.sk/media/files/next-generation-antimicrobial-dressings-aquacel-ag-extra.pdf)
   有一種新出來的抗菌敷料不用靠清創,就可以在一天之內將綠膿桿菌的生物膜的活菌總菌落數viable biofilm bacteria(CFU)減少6個零(從30億減到3千,也就是百萬分之一),而在第四天,讓生物膜數量歸零(圖2),這個資料幾乎就是細菌的『明日之後』了,對於有抗藥性的MRSA生物膜也是以每2天讓細菌減少到原本千分之一的速度,在第5天,讓生物膜數量歸零(圖3)。如此的神奇,已經比手術清創的效果還要神了,我每次在開刀房開完清創手術後,頂多只敢宣稱清完9成,需觀察個幾天,若傷口沒改善還是有可能需要再次清創。此敷料一出,大概像我這類做傷口的外科醫師就不用混了,無論如何,總還是覺得怪怪的,因為圖表的細菌單位用的是生物膜內存活細菌的『總菌落數CFU』。

圖2.綠膿桿菌生物膜被Aquacel-Ag+ extra大屠殺,資料來源:P7,
(圖片來源: http://www.woundsinternational.com/media/other-resources/_/1069/files/content_11301.pdf
http://www.convatec.sk/media/files/next-generation-antimicrobial-dressings-aquacel-ag-extra.pdf



圖3.MRSA葡萄球菌生物膜被Aquacel-Ag+ extra大屠殺,資料來源:P7,
 (圖片來源:http://www.convatec.sk/media/files/next-generation-antimicrobial-dressings-aquacel-ag-extra.pdf)
 

而什麼是CFU呢?

   菌落形成單位/毫升 (colony forming unit/ml;簡稱 cfu/ml),是計算細菌數量的一種方法,其值越高表示樣品中所含的細菌越多。菌落形成單位的計量方式與一般的計數方式不同,一般直接在顯微鏡下計算細菌數量會將活與死的細菌全部算入,但是CFU只計算活的細菌。當單一的活細菌被移植至agar培養皿,經分裂後,其會形成一個菌落。故每一個活細菌,即是由一個菌落形成單位 (Colony forming unit;簡稱 cfu) 所代表。總生菌數是指食品在經過處理,並於一定條件下進行培養後,所得1 g或1 ml檢測樣本中所含的活細菌總數。傳統的方式是將檢體經過連續稀釋(以十的倍數),然後在培養皿培養出可計算菌落數目,接著計算Plate Count。但是這個方法只能計算水中懸浮的微生物planktonic bacteria,或是遷移中的生物膜碎片,大部分的生物膜是會緊密附著於管壁,且尚未成熟的生物膜系統是不會大量移轉到水中的,且每個生物膜碎片常只能培養出單一菌落,最後,據說在傳統的agar培養皿其實培養不出生物膜,因此傳統的總菌落數CFU(應該是cfu/ml)其實不是研究生物膜的好單位。不過也許研究者用了一種特殊的方法,溶解了生物膜的EPS外衣,卻不會傷害膜內的細嫩細菌,把生物膜內的所有細菌釋放出來,再用CFU的方法研究也不一定。就讓我進一步研究其研究方法。
   根據內文,作者發展出一種實驗室的抗菌評估模式(此作者David Parsons還是Aquacel-Ag及Aquacel-Ag+專利的發明家WO2012136968 A1),用來研究Aquacel-Ag+ extra對於傷口中生物膜內細菌的抗菌效果1,2(謎之音請參考ConvaTec的內部不公開文件:1,2,這句話怪怪的),生物膜在一種低營養的培養基質中,藉著持續攪動48小時,在棉質紗布中生養。接著這生物膜的存在、成熟狀態及形狀被前文所述的雷射掃描共軛焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscopy)證實(如圖4)(謎之音:看到這裡似乎都還合理)。接著將含有生物膜的紗布物質轉移到陷在皮革表面的agar培養皿,以模擬傷口的環境(謎之音:漏餡了,agar並不是生物膜的培養環境,),接著將各種敷料(aquacel-Ag及aquacel-Ag+ extra)置於生物膜表面,加水保濕,並以第二層敷料覆蓋(看起來是防水的aquacel foam dressing),在這5天的培養中,每隔一段時間(24小時)就評估敷料對生物膜的抗菌效果(謎之音:到這個步驟為止,作者並沒有以任何方法,如超音波,將剩下殘存的生物膜打碎,以培養生物膜內的細菌,否則一個生物膜就只能培養出一個菌落),接著為了評估生物膜在被破壞後一天便會重建的條件,又緊接著將新鮮的細菌接種在敷料下面的紗布基質上,接著在其後的幾天培養並評估細菌的存活狀況(圖2及圖3)。(謎之音:圖2 MRSA的aquacel-Ag這組沒有歸零,且原本已被aquacel-Ag抑制成拉鋸狀態的30億大軍,在只補充3萬新軍後,竟然能夠隔天就迅速成長成300億大軍)

圖4.生物膜菌落在傷口的模擬模式
   其實(這裡給ConvaTec一點秀秀),根據作者David Parsons所發表Aquacel-Ag+的專利書WO 2012136968 A13上有寫到其詳細的研究方法,其利用商業模組化套件的The MBEC Assay System來培養及偵測生物膜(圖5),這方法改良自Calgary Biofilm Device抗生素對生物膜的敏感度測試方法,可同時培養及試驗96個生物膜4

圖5. MBEC™ Biofilm Assay Plate,目前已停產
(圖來自http://www.biofilms.biz/products
   把培養出來的菌體加入MBEC Assay System中,並以純水持續在所有試管內流動,以創造製造生物膜所需的剪力,培養24小時後可肉眼看到生物膜在試管底部形成,以接著洗去多餘懸浮細菌。然後放入實驗抗菌物質,持續30分,2小時及4小時,接著以超音波振盪器 sonication method將生物膜破壞,使裡面存活的細菌釋放懸浮出來,稀釋,並在另一個新的培養皿上培養24小時,接著計算菌落數(圖6)。

圖6.一個盤子有96個栓子peg ,將把培養出來的菌體加入(A),細菌慢慢附著到栓子(B),生物膜形成,以水將浮游細菌洗掉(C),加入抗菌物質(D),將抗菌劑及浮游細菌洗掉,並將栓子移走(E),以超音波震盪將栓子上的生物膜移除並使細菌懸浮(F),將充滿細菌的懸浮液稀釋(G),培養皿上培養菌落5
1.WHRI3857 MA236. Antimicrobial activity and prevention of biofilm reformation by AQUACEL Ag+ EXTRA dressing. ConvaTec data on file.
2.WHRI3875 MA239. Antimicrobial activity against CAMRSA and prevention of biofilm reformation by AQUACEL Ag+ EXTRA dressing. ConvaTec data on file
3. WO 2012136968 A1 Composition comprising antimicrobial metal ions and a quaternary cationic surfactant, http://www.google.com/patents/WO2012136968A1?cl=en
4. H. Ceri,, M. E. Olson,C. Stremick, The Calgary Biofilm Device: New Technology for Rapid Determination of Antibiotic Susceptibilities of Bacterial Biofilms, J Clin Microbiol. 1999 Jun; 37(6): 1771–1776. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC84946/
5. Herrmann G, Yang L, Wu H, Colistin-tobramycin combinations are superior to monotherapy concerning the killing of biofilm Pseudomonas aeruginosa. J Infect Dis. 2010 Nov 15;202(10):1585-92. doi: 10.1086/656788. Epub 2010 Oct 13.
http://jid.oxfordjournals.org/content/202/10/1585/F1.expansion.html

   接著是另一個研究,為了進一步瞭解生物膜被破壞及移除的現象,一種化學性的方法被研究出來6(謎之音:這方法只以海報形式發表於2013年英國的傷口年會,原海報檔為pdf),其研究方法看似合理,以aquacel, aquacel-Ag, aquacel-Ag+和biofilm接觸一天之後移開,並以鹽酸將對照組未破壞的biofilm及三種用過的敷料各自溶解,研究三種敷料及原本的生物膜內的Ca++,Mg++,K+關係,結果如下表。



表1. 研究三種敷料及原本的生物膜內的Ca++,Mg++,K+關係
   總之,結果我只看到上面這三個表,看似沒什關係,但作者在結論卻非常傻眼地說根據鉀的濃度,aquacel,aquacel-Ag及aquacel-Ag+分別可移除生物膜達37%,66%及78%,此結果也符合肉眼的觀察。(謎之音:之前不是說aquacel以及aquacel-Ag無法殺死或破壞生物膜嗎?)
   最後,我開始懷疑為何一個國際期刊會刊出這種不嚴謹的文章,連參考文獻都可以用內部資料帶過,最後找到說這些文章其實是出自於wound international的resource部分(http://www.woundsinternational.com/resources/biofilms),這部分的文章為由各贊助廠商所提供的衛教文章(廣告文),如一些Made Easy類的文章(如前文),當然有其商業的考量,但是作為臨床研究者,實在應該尋找一些真的經過peer review的文章,比如說aquacel Ag+和aquacel Ag相比,多了哪些成分,以及為何可以殺掉生物膜的機轉。
6.Parsons D, Short D, Meredith K, Rowlands V (2013). A new anti-biofilm Hydrofiber dressing: demonstrations of enhanced silver penetration and biofilm removal in vitro. Poster 215. Presented at Wounds UK 2013, Harrogate, UK: 11–13 November. SC-000388-GB. http://www.convatec.sk/media/files/2013-poster-215-parsons-aqagplus-penetration.pdf